Avaliação pré-clínica de canabinoides

Efeitos de fitocanabinoides sobre doenças do sistema nervoso central: uma abordagem de estudos-não clínicos.

Por Agatha Cardoso | 07 de junho de 2023

Esse conteúdo faz parte da série “Cannabis: Conhecimentos Científicos made in Brazil”, em que o site Green Science Times reproduzirá artigos técnicos e científicos, produzidos por especialistas que compõem o Grupo de Trabalho Farmacêutico da Associação Brasileira das Indústrias de Cannabis (ABICANN).

Nos créditos, acima e no final da página, será possível que você conheça um pouco mais sobre os perfis destas e destes profissionais, que contribuem para orientação de interessados em pesquisas, ciências, saúde e inovações com a planta Cannabis sativa. Acompanhe o artigo desta edição:

Autores: Yolanda Paes Colli (M.Sc., Farmacêutica), Isabela Favorito Santos (M.Sc., Biotecnologista) e Raquel Maria Pereira Campos (PhD, Biomédica).

Coordenação: Fábio de Oliveira Costa Junior.

1. Conceitos acerca de pesquisas não-clínicas 

A pesquisa científica é composta de diferentes etapas, sendo as 3 principais: básica, não-clínica e clínica. A pesquisa básica envolve o descobrimento e desenvolvimento de novas drogas e compostos. Em seguida, dá-se início aos estudos não-clínicos, que têm como objetivo avaliar a possibilidade de um potencial terapêutico de um composto, podendo este ser tanto in vitro (testado em modelos de cultivo celular) quanto in vivo (testado em modelo animal). 

O estudo pré-clínico ou não-clínico é ainda dividido em 3 fases (MERGENTHALER; MEISEL, 2021) (Figura 1), sendo a primeira delas a fase de prova de conceito, em que é avaliado o efeito que o medicamento tem sobre a doença alvo do estudo. A segunda fase é caracterizada pela análise da sua eficácia quanto ao efeito que proporciona, bem como de sua toxicidade. Ambos os fatores são cruciais para o estudo de um medicamento, para manter a segurança dos indivíduos que receberão o tratamento, bem como a aplicabilidade daquela droga. Durante esta fase do estudo, é necessário que diversos requisitos sejam seguidos de acordo com as leis regulatórias do local onde está sendo realizado o estudo, como a pré-aprovação do estudo pelo comitê de ética de uso de animais para experimentação e a farmacopeia (SHEGOKAR, 2020). Por fim, a última fase da pesquisa não-clínica é o ensaio não-clínico randomizado (MERGENTHALER; MEISEL, 2021), em que é possível reduzir vieses e tornar o estudo mais rigoroso.

Os ensaios com a utilização de animais devem determinar inicialmente qual modelo a ser utilizado, considerando suas semelhanças com seres humanos de acordo com a fisiopatologia, características fenotípicas, biomarcadores da doença, resposta à terapia e toxicidade (MERGENTHALER; MEISEL, 2021). Entretanto, existem fatores que não são possíveis de serem considerados nos estudos não-clínicos, como a presença de outras comorbidades no indivíduo. Desta maneira, os estudos não-clínicos demonstram ser relevantes para a simulação do cenário clínico e melhor entendimento da resposta de um fármaco frente à uma patologia. Logo, pontos como idade e sexo dos animais utilizados também se tornam informações necessárias para o avanço do ensaio não-clínico. 

2. Principais patologias estudadas na pesquisa não-clínica envolvendo fitocanabinoides.

Os modelos animais utilizados na pesquisa não-clínica dependem do tipo de manifestação clínica que se deseja estudar em uma determinada patologia. Logo, uma única patologia pode ter diversos modelos animais e os critérios que devem ser empregados para a escolha de um dado protocolo deve se basear em que extensão o modelo de fato reproduz com alguma similaridade o dano tecidual, as modificações nas estruturas e os sintomas de uma dada patologia e do mecanismo de ação dos compostos terapêuticos que se deseja avaliar. Dentro da pesquisa não-clínica com fitocanabinoides, podemos observar diversos avanços em estudos e o uso de modelos distintos, destacando-se algumas patologias de origem neurológica.

2.1. Epilepsia

2.1.1. Modelos não-clínicos mais utilizados

A epilepsia é possivelmente a patologia mais estudada na pesquisa não-clínica, a partir da observação dos efeitos dos fitocanabinoides, uma vez que essa doença foi uma das primeiras a utilizar produtos derivados de Cannabis como terapia. Por existirem diferentes manifestações epilépticas em humanos, ao longo dos anos cientistas focaram em desenvolver uma gama de modelos animais que mimetizam os distúrbios de neurotransmissão de acordo com os mecanismos celulares e as manifestações clínicas apresentados em cada caso (KANDRATAVICIUS et al., 2014). 

A administração de quimioconvulsivantes é uma metodologia utilizada para gerar convulsões espontâneas recorrentes em roedores, com intenção de mimetizar a epilepsia do lobo temporal apresentada por humanos. Um dos primeiros modelos quimioconvulsivantes desenvolvidos foi o modelo do ácido kaínico, um análogo do glutamato, principal neurotransmissor excitatório presente no sistema nervoso. Sua administração leva à despolarização neuronal e ao desenvolvimento de convulsões, com lesões geralmente restritas ao hipocampo (SHARMA et al. 2007; RAEDT; VAN DYCKE; VAN MELKEBEKE, 2009).

Outro modelo de quimioconvulsivante também amplamente utilizado é a pilocarpina, um agonista de receptores colinérgicos muscarínicos, e sua administração leva ao desenvolvimento de lesões e convulsões recorrentes similares às convulsões parciais complexas apresentadas por humanos. Em comparação com o ácido kaínico, a administração de pilocarpina pode produzir lesões em áreas além do hipocampo, como o córtex (CAVALHEIRO et al., 1991; FURTADO et al., 2002). Outros compostos podem ser utilizados com o objetivo de avaliar um evento convulsivo agudo de forma pontual, não sendo considerados modelos de epilepsia; destaca-se nesse aspecto o pentilenotetrazol (PTZ), utilizado no desenvolvimento de episódios de ausência não-convulsiva ou convulsões mioclônicas (LÖSCHER, 1997). 

Os modelos induzidos por estimulação elétrica também são comumente utilizados no desenvolvimento da epilepsia experimental. A estimulação elétrica tem como vantagem a reprodução dos eventos epilépticos com baixa mortalidade e alta reprodutibilidade, além da possibilidade de investigação de alterações pós-ictais causadas pelo estímulo sem a presença do mesmo. Um dos modelos mais estudados é o modelo de convulsões induzidas por eletrochoque, onde um único eletrochoque é aplicado, sem necessidade de procedimentos invasivos, de forma que todo o cérebro recebe estímulo.  Pode ser considerado como eletrochoque mínimo, associado ao comportamento de convulsões mioclônicas mínimas, ou eletrochoque máximo, associado majoritariamente às convulsões tônico-clônicas generalizadas (LÖSCHER; SCHMIDT, 1988; FRANKEL et al., 2001).

Outro modelo estudado atualmente é o modelo de kindling. Kindling (em inglês, ignição) se refere a um fenômeno de convulsão induzida por plasticidade que ocorre quando a indução de pós-descargas causadas por uma estimulação elétrica em uma região do cérebro leva a um aumento progressivo na susceptibilidade à convulsão. Com isso, culmina na produção de convulsões espontâneas e no estabelecimento de um estado epiléptico permanente que pode evoluir de convulsões parciais a generalização secundária. Esse modelo permite uma avaliação de forma consistente dos mecanismos que geram a epilepsia, além de promover alterações celulares cumulativas nos circuitos, que eventualmente resultam em convulsões espontâneas, permitindo o estudo dos processos relevantes para a epilepsia do lobo temporal (GODDARD; MCINTYRE; LEECH, 1969).

Existem ainda modelos que mimetizam insultos associados a etapas do desenvolvimento cerebral que, por sua vez, relacionam-se com a susceptibilidade a convulsões. As convulsões febris, por exemplo, podem levar ao desenvolvimento de epilepsia do lobo temporal, e os modelos animais estudados permitem investigar se e como essas convulsões podem induzir dano neural levando ao desenvolvimento de epilepsia. Animais de baixa idade são expostos a fluxos de ar quente entre 40-42 ºC durante certo período, o que estimula episódios de convulsões mais sutis que outros modelos. Outro modelo de convulsão por hipertermia é o modelo de alcalose respiratória, induzido pela administração sistêmica de bicarbonato (PTIKÄNEN; SCHWARTZKROIN; MOSHÉ, 2006; SCHUCHMANN et al., 2006).

Os modelos de epilepsia pós-traumática, que se desenvolvem após episódios de traumatismo cranioencefálico, são modelos que se manifestam de forma heterogênea, uma vez que nem todas as lesões traumáticas ocorrem da mesma forma. O modelo mais utilizado atualmente é o modelo de lesão por percussão fluida, onde um único episódio é capaz de gerar uma epilepsia pós-traumática, correlacionando-se em sua progressão de epilepsia frontoparietal até epilepsia do lobo temporal mesial, e apresenta características patológicas envolvendo o hipocampo. Esse modelo pode não mimetizar tão bem a epileptogênese por ser muito difuso, e diversos modelos podem ser necessários para se fazer uma comparação com o desenvolvimento das manifestações patológicas (D’AMBROSIO et al., 2005; KHARATISHVILI et al., 2006). 

Por fim, os modelos genéticos também são bastante utilizados no estudo não-clínico de epilepsias. Alguns deles já foram desenvolvidos para mimetizar convulsões audiogênicas, por exemplo, provocadas por estímulos acústicos de alta intensidade. Esses animais são extremamente sensíveis a estímulos acústicos, onde um único estímulo pode levar a uma convulsão reflexa semelhante à vista em humanos, com manifestações como corrida desenfreada, fase tônico-clônica e eventos pós-ictais, que podem variar entre as linhagens de animais. Entre elas, destacam-se as linhagens de ratos Wistar Albino Glaxo/Rijwijk (WAG/Rij), Wistar Audiogenic Sensitive e Wistar Audiogenic Rat (WAR). Além disso, pode-se aplicar, em algumas linhagens, um protocolo de kindling audiogênico. Os modelos de epilepsia audiogênica têm sido usados também para estudar comorbidades associadas a epilepsias, como depressão e ansiedade, e modalidades de diferentes manifestações epilépticas, como o desenvolvimento de convulsões ou ausências (GARCIA-CAIRASCO; TERRA; DORETTO, 1993; VAN LUIJTELAAR; COENEN, 1986; MARESCAUX et al., 1987; DORETTO et al., 2003). 

2.1.2. Estudos não-clínicos utilizando fitocanabinoides

As primeiras evidências de que fitocanabinoides não-psicotrópicos poderiam ser utilizados no combate a convulsões começaram a surgir no início da década de 1970, quando através de modelos de indução farmacológica e elétrica de eventos epilépticos em roedores, constatou-se a atividade anticonvulsivante do canabidiol (CBD) (CARLINI et al., 1973; KARLER, CELY e TURKANIS, 1973). Em camundongos, a ativação do receptor CB1 foi capaz de gerar resposta anticonvulsivante ao reduzir a hiperexcitabilidade neuronal, efeito também observado com a administração de CBD (WALLACE et al_., 2001). Outro mecanismo de ação que pode contribuir para o efeito anticonvulsivo do CBD refere-se à ativação e dessensibilização de receptores TRPV1 (IANNOTTI et al., 2014). Além disso, o CBD também pode atuar sobre o sistema serotoninérgico como agonista inverso de receptores 5-HT_1A quando administrado em alta concentração, levando a expressão de mais receptores na superfície celular e, consequentemente, modulando a atividade excitatória neuronal (MARTÍNEZ-AGUIRRE et al., 2020).

O pré-tratamento com CBD e a posterior injeção intraperitoneal com pilocarpina promoveu a diminuição de diversos parâmetros associados ao comportamento convulsivo em animais, tais como: a torção de patas dianteiras, enquanto o animal se sustenta nas patas traseiras e cai para a lateral; e ocorrências de convulsões tônico-clônicas (JONES et al., 2012). Utilizando o mesmo modelo, observou-se também que o tratamento com CBD promove a redução do comportamento relacionado à epilepsia, além de ter efeito neuroprotetor em vias de sinalização na região do hipocampo na fase crônica (HOSSEINZADEH et al., 2016).

Observou-se que o CBD auxilia na redução da severidade de convulsões e mortalidade em modelo de convulsão generalizada por injeção intraperitoneal de PTZ (JONES et al., 2010). Utilizando o mesmo modelo, a elevação da dose de CBD promoveu a melhora do score diário relacionada com as alterações comportamentais associadas ao evento convulsivo, além de reduzir a perda neuronal e aumento da reatividade glial no hipocampo (MAO et al., 2015).

Yu e colaboradores, utilizando a indução da convulsão por hipertermia em animais, constataram que o tratamento com CBD promoveu o aumento da latência para o desencadeamento de um evento convulsivo, tal como sua severidade. O mesmo grupo ainda demonstrou que esse efeito possui uma interação entre CBD e subunidades GluA1 e GluA2 do receptor AMPA, promovendo uma modulação que culmina na redução das correntes excitatórias pós-sinápticas evocadas e mediadas por AMPA (YU et al., 2020).

Com o intuito de investigar o efeito do CBD sobre a hiperexcitabilidade neuronal, um estudo mostrou, utilizando fatias de hipocampo obtidas de animais que receberam injeção intraperitoneal de ácido kaínico, que a adição de CBD ao meio na concentração de 10 uM promoveu a redução do potencial excitatório pós-sináptico nas células piramidais. Desta forma, evidenciou-se maior redução na amplitude desses potenciais quando o potencial de membrana está mais elevado, além de reduzir a morte celular de interneurônios associados a disparos mais rápidos (KHAN et al., 2018). Esses dados sugerem uma maior eficácia do CBD justamente nos neurônios que estão recebendo maior quantidade de inputs excitatórios, preservando também integridade de interneurônios, que balanceiam o equilíbrio excitação/inibição.

Outros fitocanabinoides minoritários ou de outra classificação química como, por exemplo, terpenos e flavonoides, podem atuar sobre componentes do sistema endocanabinoide. Utilizando um modelo genético de Síndrome de Dravet, foi avaliada a atividade do ácido canabigerólico (CBGA) sobre as convulsões. Foi demonstrado que o CBGA promove o aumento da frequência de convulsões em modelo induzido por hipertermia. Porém, quando administrado em concomitância com clobazam, é capaz de potencializar o efeito anticonvulsivante desse fármaco. Quando empregado como tratamento em outros modelos clássicos de indução de convulsões, o CBGA demonstrou um papel dual, atuando como anticonvulsivante em modelo de eletrochoque máximo e pró-convulsivante no teste de limiar de 6 Hz (ANDERSON et al., 2021a). 

Outro fitocanabinoide minoritário, a canabidivarina (CBDV) quando administrada em animais, promoveu redução do número de indivíduos que apresentaram extensão tônica das patas traseiras e convulsões tônicas, além de reduzir a mortalidade e aumentar o número de animais livres de convulsões (HILL et al., 2012).

O tratamento oral com CBDV também reduziu a severidade e tempo de latência para início das convulsões em modelo com PTZ, promovendo ainda a supressão da expressão de genes associados à epilepsia (AMADA et al., 2013). Investigou-se também o papel do canabicromeno (CBC) em modelos de epilepsia. Em modelo de Síndrome de Dravet, camundongos tratados com CBC apresentaram maior resistência ao início de um evento convulsivo, de modo que o limiar de temperatura necessário para indução de convulsão por hipertermia foi elevado (ANDERSON et al., 2021b). 

Os terpenos também podem exercer atividade anticonvulsivante por mecanismos de ação diferentes. Nesse sentido, destaca-se o β-cariofileno, encontrado na Cannabis sp. e em outras espécies vegetais, com ação agonista sobre receptores CB2 (GERTSCH et al., 2008). Após indução de convulsão por PTZ e tratamento com β-cariofileno, foi observado o aumento do tempo de latência para que o animal inicie um evento mioclônico, efeito corroborado pela avaliação eletroencefalográfica (DE OLIVEIRA et al., 2016). Em modelo de ácido kaínico, a administração desse terpeno apresentou efeito importante na redução da severidade da convulsão, além de melhora cognitiva (TCHEKALAROVA et al., 2018) (Figura 2; Tabela 1).

Quando consideramos tratamentos com extratos de Cannabis sp., é importante avaliar as potenciais interações farmacocinéticas e farmacodinâmicas entre os componentes individuais da planta, que atuam de forma sinérgica no chamado efeito comitiva. Anderson e colaboradores testaram o potencial anticonvulsivo de CBD e THC, isoladamente e em conjunto, e observou-se que baixas doses de THC apresentam efeito anticonvulsivante, tendo a atividade potencializada pela coadministração com CBD, mesmo o último estando em dose abaixo do mínimo capaz de, isoladamente, promover ação anticonvulsivante. Entretanto, a utilização da combinação de CBD e THC em duas doses diferentes promoveu efeito contrário quando administrado pela via oral, ocasionando piora da severidade das convulsões e maior taxa de mortalidade, sugerindo ainda que a interação farmacocinética desses compostos deve ser acompanhada com cautela em caso de uso na terapêutica clínica (ANDERSON et al., 2020) (Tabela 1). Com a lógica das interações medicamentosas, estudos foram publicados explorando as interações farmacocinéticas entre CBD e outros medicamentos utilizados na prática clínica no tratamento da epilepsia, destacando-se clobazam, topiramato, zonisamida, eslicarbazepina e rufinamida, que apresentaram aumento da biodisponibilidade no plasma sanguíneo após tratamento concomitante com CBD (GEFFREY et al., 2015; GASTON et al., 2017).

Artigo	Modelo	Composto utilizado	Resultados
Carlini et al., 1973	Indução pelo quimioconvulsivante leptazol em camundongos e estímulos audiogênicos em ratos Wistar	Pré-tratamento com 10-200 mg/kg (i.p.) CBD (camundongos) e 20 mg/kg (i.p.) de extrato de Cannabis sp. (ratos)	Proteção contra o desenvolvimento de eventos epileptogênicos
Karler, Cely e Turkanis, 1973	Indução por eletrochoque máximo em camundongos	Pré-tratamento com curva dose-resposta de Δ9-THC, CBD ou CBN	Todos os fitocanabinoides apresentaram eficiência em prevenir a indução dos eventos epileptogênicos, com CBD e THC tendo as melhores respostas
Wallace et al., 2001	Indução por eletrochoque máximo em camundongos	Pré-tratamento com curva dose-resposta de THC, CBD ou agonista ou antagonista de receptor CB1	O efeito anticonvulsivante de THC é mediado via CB1, enquanto o efeito mediado por CBD não.
Jones et al., 2010	Indução pelo quimioconvulsivante PTZ	CBD (1, 10 e 100 mg/kg, i.p.)	CBD 100 mg/kg teve efeito anticonvulsivante, diminuiu a incidência de convulsões severas e mortalidade.
Hill et al., 2012	Indução por eletrochoque máximo, estímulos audiogênicos, PTZ e pilocarpina	CBDV 50-200 mg/kg (i.p.)	Os efeitos anticonvulsivantes foram efetivos nos modelos de eletrochoque, estímulos audiogênicos e PTZ, e no modelo de pilocarpina atenuou as convulsões quando administrado com antiepiléticos.
Jones et al., 2012	Indução pelo quimioconvulsivante pilocarpina e por penicilina	CBD (1, 10 e 100 mg/kg, i.p.)	No modelo de pilocarpina, todas as concentrações reduziram o número de animais com convulsões severas. No modelo de penicilina, CBD >10 mg/kg diminuiu a mortalidade, e todas as doses diminuíram o número de animais com convulsões tônico-clônicas severas.
Amada et al., 2013	Indução pelo quimioconvulsivante PTZ	CBDV (400 mg/kg, via oral)	Diminuição da severidade das convulsões e da expressão de mRNA de genes relacionados com epilepsia.
Mao et al., 2015	Indução pelo quimioconvulsivante PTZ	Pré-tratamento com CBD (10, 20 e 50 mg/kg, i.p.)	Melhora do score de comportamento relacionado aos eventos convulsivos, redução da perda neuronal e da reatividade glial
De Oliveira et al., 2016	Indução pelo quimioconvulsivante PTZ	β-cariofileno (10, 30, 100 mg/kg, i.p.)	β-cariofileno 100 mg/kg promoveu aumento no tempo de latência para início de eventos convulsivos.
Hosseinzadeh et al., 2016	Indução pelo quimioconvulsivante pilocarpina	CBD (100 ng, i.c.v.)	CBD administrado durante a fase crônica da convulsão diminuiu os scores epilépticos e ativação de vias neuroprotetores.
Khan et al., 2018	Indução pelo quimioconvulsivante ácido kaínico	CBD 10 µM (em fatias de hipocampo) e CBD (100 mg/kg, i.p.)	Redução no potencial excitatório pós-sináptico de células piramidais, redução na atrofia e redução da morte celular de interneurônios.
Tchekalarova et al., 2018	Indução pelo quimioconvulsivante ácido kaínico	Pré-tratamento com β-cariofileno (50 e 100 mg/kg, i.p.)	Diminuição da severidade da convulsão e melhora cognitiva
Anderson et al., 2020	Modelo genético de síndrome de Dravet	CBD (100 mg/kg, i.p) e CBD (12 mg/kg, i.p) + THC (0,1 mg/kg, i.p.)	Apenas CBD 100 mg/kg possui efeitos anticonvulsivantes, contudo a combinação de baixa doses de CBD e THC ocasionou piora da mortalidade e severidade das convulsões.
Yu et al., 2020	Modelo de convulsão por hipertermia induzida por LPS	Pré-tratamento com CBD (3, 10 ou 30 mg/kg, i.p.)	Maior tempo de latência para desenvolvimento de convulsões e menor severidade, e interação com subunidades de AMPAR, reduzindo correntes excitatórias pós-sinápticas.
Anderson et al., 2021a	Modelo genético de síndrome de Dravet e modelos de eletrochoque	CBGA (1400 mg/kg e 2500 mg/kg), clobazam (80 mg/kg) e CBGA + clobazam (1400 mg/kg + 80 mg/kg), via oral	CBGA apresentou efeitos anticonvulsivantes potentes e potencializados por clobazam, exceto no modelo de limiar de 6 Hz, onde se mostrou pró-convulsivante.
Anderson et al., 2021b	Modelo genético de síndrome de Dravet	CBC (10, 30 e 100 mg/kg, i.p.)	CBC 100 mg/kg aumentou o limiar de temperatura para o desenvolvimento de convulsões.

2.2. Transtorno do espectro autista

2.2.1. Modelos não-clínicos mais utilizados

O transtorno do espectro autista (TEA) é caracterizado por prejuízo na interação social e na comunicação de um indivíduo. Entretanto, também afeta outros comportamentos como aprendizado, memória e resposta emocional. Os primeiros estudos envolvendo o sistema endocanabinoide e TEA envolveram pacientes humanos; foi observado que os indivíduos com TEA apresentavam alterações nos níveis de componentes do sistema endocanabinoide, como redução da concentração de anandamida, palmitoiletanolamida e oleoiletanolamida, bem como diferenças nos níveis de receptores e enzimas do sistema endocanabinoide. Com as diferenças observadas em humanos, iniciaram-se estudos não-clínicos para potencial modulação do sistema endocanabinoide a fim de reverter comportamentos associados ao TEA.

Os animais utilizados nos ensaios não-clínicos e considerados modelos de TEA devem apresentar um conjunto de características similares ao comportamento de pacientes humanos autistas. Entretanto, é importante ressaltar que indivíduos com TEA também podem apresentar outras patologias, o que leva à limitação dos modelos animais na simulação do quadro clínico.

Um dos modelos animais mais utilizados no estudo de TEA é a administração de ácido valproico (VPA) durante a gestação de roedores. O VPA é utilizado na clínica como um anticonvulsivante; entretanto, pode induzir TEA em embriões. Este modelo simula infecções virais ou bacterianas durante o período pré-natal e pós-natal (ao longo da amamentação). O composto é administrado em fêmeas grávidas no 12º dia de gestação, e a prole desenvolverá TEA. Nesse modelo, foi observado que os animais expostos ao VPA durante o período embrionário apresentaram um aumento de latência na resposta a um estímulo térmico, indicando o desenvolvimento de hipoalgesia. Além disso, em ensaios de sociabilidade, os animais VPA demonstraram comprometimento no aspecto de interação com novos animais. O sistema endocanabinoide também se encontra alterado neste modelo, com redução da concentração das enzimas MAGL no hipocampo e DAGLα no cerebelo (KERR et al., 2013).

A síndrome do X frágil é caracterizada pelo silenciamento do gene FMR1. Consequentemente, há ausência da proteína de retardamento mental do X frágil. Logo, animais nocautes para FMR1 apresentam comportamento dentro do TEA, e são utilizados em ensaios não-clínicos, como a análise de inibidores de atividade enzimática da FAAH. Foi observado que os animais nocaute apresentaram recuperação da memória por meio da ativação da via de anandamida (QIN et al., 2015).  

Outro modelo não-clínico utilizado para TEA é a administração de lipopolissacarídeos (LPS) em uma fêmea grávida durante o período pré-natal, mimetizando uma infecção (ZAMBERLETTI, GABAGLIO, PAROLARO, 2017). Como efeitos após o nascimento, se observa aumento da ansiedade e diminuição das interações sociais; bem como diferenças a nível celular, com aumento da densidade e da excitabilidade de neurônios piramidais. Esse modelo apresenta redução na afinidade do receptor CB1, aumento dos níveis de anandamida e da atividade de FAAH na amígdala.

Existem também dois modelos genéticos de animais utilizados na pesquisa não-clínica para estudo do TEA. O primeiro deles refere-se a animais nocautes ou com mutação de uma molécula de adesão pós-sináptica chamada de neuroligina 3. Esse nocaute gera comportamentos similares ao TEA, como dificuldade de interação social e desarranjo intelectual (ZAMBERLETTI, GABAGLIO, PAROLARO, 2017). 

Contudo, este modelo não reflete grande parte dos aspectos do comportamento autista, sendo, portanto, menos utilizado. Já a segunda proposta de modelo animal para TEA refere-se ao autismo idiopático, em que é desconhecida a alteração genética que leva ao fenótipo. É um animal da linhagem BTBR, que apresenta comportamentos similares a um paciente que possui TEA. Entretanto, poucos trabalhos utilizam este modelo em seus estudos (ZAMBERLETTI, GABAGLIO, PAROLARO, 2017).

2.2.2. Estudos não-clínicos utilizando fitocanabinoides

Ainda que a CBDV não seja o principal composto presente na Cannabis sativa, esta molécula também tem ação sobre o sistema endocanabinoide. Um estudo avaliou se, após a administração dessa substância ao longo de 1 mês em animais modelos de TEA, há alteração em seu comportamento social. Foi observado então que parâmetros como déficit de memória de reconhecimento, hiperatividade, sociabilidade e auto-grooming repetitivo apresentaram melhora após o uso de canabidivarina (ZAMBERLETTI, GABAGLIO, WOOLLEY-ROBERTS et al., 2019). Dado que este composto já foi descrito como tendo ação sobre receptores GABAérgicos, que são inibitórios, é possível que estes animais apresentaram melhora devido à sinalização GABAérgica pela administração de CBDV.

Mais recentemente, pesquisadores investigaram o comportamento de animais com uma mutação humana de Shank3 durante um tratamento via oral de 3 semanas com óleo medicinal de Cannabis sp. enriquecido com CBD (POLEG et al., 2021). A primeira informação obtida deste tratamento foi a melhora significativa nos animais com a mutação com relação ao comportamento de grooming repetitivo e excessivo. Entretanto, o tempo de tratamento utilizado foi o suficiente para observação de melhora no quadro dos animais. Além disso, também foi observado uma melhora no aspecto de ansiedade, após ensaios comportamentais. Entretanto, um aspecto social não foi retomado: os animais com a mutação passaram menos tempo interagindo com animais novos do que os demais grupos.

Ainda neste mesmo trabalho, foi visto que o receptor CB1 está envolvido na sinalização em torno do comportamento de grooming no modelo da mutação de Shank3, visto que após o tratamento com o óleo houve redução desse comportamento. Porém, com o antagonista de CB1, esse efeito foi revertido (POLEG et al., 2021). Entretanto, ressaltando o efeito comitiva dos componentes no óleo, o tratamento com CBD isolado não foi capaz de reverter o quadro do animal com a mutação de Shank3. Enquanto isso, o óleo à base de THC também foi capaz de diminuir o comportamento de grooming dos animais; porém também por meio do receptor CB1 (Figura 3; Tabela 2).  

A relevância dos dois trabalhos mencionados acima baseia-se nos avanços na pesquisa não-clínica para o tratamento de TEA com relação aos comportamentos de sociabilidade, mas também a diferentes compostos demonstrando potencial na terapêutica. 

Artigo	Modelo	Composto utilizado	Resultados
Zamberletti et al., 2019	Indução por administração de ácido valproico durante a gestação	CBDV 0,2-100 mg/kg para animais sintomáticos ou 2-20 mg/kg de forma preventiva (i.p.)	Melhora na memória, hiperatividade, sociabilidade e comportamento de grooming
Poleg et al., 2021	Modelo genético de mutação em Shank3	Extrato enriquecido em CBD (25 mg/kg) ou THC (1mg/kg) via oral	Melhora no comportamento de grooming e melhora na ansiedade, dependente do receptor CB1

2.3. Esclerose múltipla

2.3.1. Modelos não-clínicos mais utilizados

A esclerose múltipla é uma doença de origem autoimune com etiologia ainda muito incompreendida. Diversos fatores são considerados como fatores de risco para o desenvolvimento dessa patologia, como por exemplo, infecções pelo vírus Epstein-Barr, deficiência em vitamina D e exposição a toxinas. Assim, os modelos animais desenvolvidos de forma a mimetizar a esclerose múltipla têm contribuído para os estudos acerca de como essa doença se desenvolve, podendo representar os vários estágios de progressão da doença (BURROWS et al., 2019). 

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo atualmente mais utilizado para se estudar a esclerose múltipla, uma vez que se baseia em um insulto inflamatório no Sistema Nervoso Central (SNC), levando à indução de resposta imune contra antígenos dessa região afetada. A EAE pode ser induzida de duas formas: pela imunização com peptídeos do SNC ou transfecção de linfócitos T causadoras de encefalite. A imunização com peptídeos pode ser promovida por peptídeos reagentes do SNC, principalmente proteínas que fazem parte da composição da mielina, substância afetada na esclerose múltipla, como por exemplo a glicoproteína da mielina de oligodendrócito (MOG) e proteína básica de mielina (MBP).

Esses peptídeos são emulsificados em adjuvante de Freund (um composto conhecido em modelos de reação inflamatória) e patógenos ou toxinas, de forma a mimetizar a ativação imune e aumentar a eficiência da indução do modelo. Assim, a imunização resulta na ativação de linfócitos T com antígenos específicos para a mielina e proliferação/diferenciação em células efetoras, além de mecanismos celulares que permitam que essas células possam invadir o SNC e promover reações inflamatórias resultando na liberação de citocinas pró-inflamatórias e recrutamento de células de defesa, e na degeneração da bainha de mielina.

Diversos tipos de protocolos podem ser utilizados no desenvolvimento desse modelo, de acordo com o tipo de antígeno utilizado, o tipo de indução, as linhagens e espécies de animais utilizados e de acordo com o estágio da doença que se tem interesse em avaliar (CONSTANTINESCU et al., 2011; MILLS, 2011). Já o método de transfecção de linfócitos T permite avaliar melhor as vias e os mecanismos que essas células ativam em sua migração ao SNC, ao permitir maior controle sobre a indução da doença e até mesmo o acompanhamento do trajeto percorrido pelas células durante o desenvolvimento do modelo (RAINE; MOKHTARIAN; MCFARLIN, 1984; CROSS; RAINE, 1990). Também muito utilizado no estudo da esclerose múltipla, o modelo viral de encefalomielite murina de Theiler é um modelo de doença desmielinizante baseado em uma patogênese viral e imune, e representa um processo crônico que dura por toda a vida dos animais. A desmielinização desse modelo depende da resposta imune do hospedeiro à presença do vírus, e o processo fisiopatológico consiste na presença de placas desmielinizantes em regiões relacionadas à presença da infiltração de células mononucleares (DAL CANTO et al., 1996).

Existem também modelos de degeneração da bainha de mielina por meio da administração de compostos que afetam diretamente essa estrutura. O modelo de desmielinização e remielinização por administração de cuprizona utiliza esse composto principalmente no estudo dos mecanismos envolvendo morte e migração de oligodendrócitos (células responsáveis pela produção da mielina no SNC) e os fenômenos de mielinização e remielinização (CARLTON, 1966).

2.3.2. Estudos não-clínicos utilizando fitocanabinoides

A Cannabis sp. e seus derivados têm seu potencial terapêutico atualmente explorado em especial em patologias nas quais a terapia disponível atualmente é ineficaz no tratamento dos sintomas, como a esclerose múltipla. Assim, diversos estudos vêm mostrando o potencial do CBD sobre a esclerose múltipla, principalmente a respeito de suas propriedades imunomoduladoras, podendo atuar sobre os linfócitos T infiltrados no SNC e sobre os níveis de citocinas pró-inflamatórias (OZAROWSKI et al., 2021).

Kozela e colaboradores mostraram, em um modelo de EAE, o efeito do CBD numa concentração de 5 mg/kg sobre parâmetros inflamatórios em camundongos. Observou-se que os animais apresentaram uma atenuação na quantidade de linfócitos T infiltrados na medula espinal, além de uma redução na quantidade e na reatividade microglial (KOZELA et al., 2011). Outro estudo utilizando modelo viral de esclerose múltipla mostrou que o CBD na mesma concentração também foi capaz de reduzir a infiltração de células imunes no cérebro dos animais infectados, a reatividade microglial no cérebro e na medula espinal, e provocou melhora no déficit motor desses animais.

O estudo mostra também um possível papel dos receptores de adenosina A como alvo do CBD, uma vez que o tratamento concomitante de CBD e o bloqueio desse receptor mitigou os efeitos protetores do CBD (MECHA et al., 2013). Ainda utilizando CBD, Rahimi e colaboradores mostraram, uma melhora na progressão da doença e nos sinais neurocomportamentais, nos achados indicativos de desmielinização e infiltração de células imunes na medula espinal, na diminuição da reatividade microglial também na medula espinal e na diminuição da expressão de citocinas pró-inflamatórias (RAHIMI et al., 2015).

Também foi mostrado que o CBD é capaz de induzir células supressoras de origem mieloide, inibindo a proliferação de linfócitos T induzidos pelo modelo de EAE, diminuição da liberação de citocinas pró-inflamatórias e diminuição do score clínico dos animais (ELLIOTT et al., 2018). Um estudo de Buccellato e colaboradores mostrou curiosamente que a administração crônica de extrato rico em Δ⁹-tetraidrocanabinol (Δ⁹-THC) resultou em uma redução significativa dos déficits neurológicos em um modelo de encefalite autoimune experimental crônica remitente (CREAE). O CBD, no entanto, só foi capaz de produzir uma redução do score neurológico durante a fase de crise (BUCCELLATO et al., 2011).

Outros estudos mostram também o efeito de extratos combinados contendo Δ⁹-THC e CBD no tratamento de sinais e sintomas em modelos animais de esclerose múltipla. Um estudo de Moreno-Martet e colaboradores mostrou que um extrato com combinação desses fitocanabinoides em proporção 1:1, CBD isolado ou Δ⁹-THC isolado tiveram efeito positivo sobre o score clínico da doença, mas apenas a combinação CBD/THC e o THC sozinho conseguiram manter essa redução ao longo do tempo, melhorando a progressão da doença. Os resultados sugerem que os efeitos sobre o score clínico podem ser mediados por receptores CB1, uma vez que o bloqueio desse receptor mitigou o efeito de melhora, além desses fitocanabinoides atuarem sobre o acúmulo de agregados celulares na medula espinal e a reatividade microglial (MORENO-MARTET et al., 2015).  

Zhou e colaboradores também demonstraram que a administração de um extrato na proporção de 1:1 desses fitocanabinoides melhorou os scores clínicos neurológicos dos animais em modelo de EAE (ZHOU et al., 2019). Em um modelo de esclerose múltipla viral, foi demonstrado que o extrato contendo Δ⁹-THC e CBD ou os fitocanabinoides isolados melhoraram a função motora. Além disso, o extrato combinado recuperou a morfologia da bainha de mielina e preveniu dano axonal na medula espinal dos animais infectados, diminuiu a quantidade de leucócitos infiltrados, a reatividade astrocitária e microglial e a expressão de citocinas pró- e anti-inflamatórias (FELIÚ et al., 2015). Outro estudo comparou a eficácia do extrato de Δ⁹-THC e CBD em inibir a espasticidade em modelo de CREAE, comparado com o baclofeno, fármaco atual utilizado no tratamento desse sintoma, obtendo resposta tão eficiente quanto a terapia atual (HILLIARD et al., 2012).

Por fim, alguns poucos estudos tentam avaliar não só a eficácia dos fitocanabinoides, mas também dos terpenos presentes na Cannabis sp.. Um estudo de Alberti e colaboradores mostrou que a administração de β-cariofileno em um modelo de EAE inibiu a resposta de linfócitos T e consequentemente a produção de citocinas pró-inflamatórias, além de atenuar a severidade da doença quando avaliado o score clínico e o peso do animal, o estresse inflamatório e a desmielinização na medula espinal (ALBERTI et al., 2017) (Figura 4; Tabela 3).

Artigo	Modelo	Composto utilizado	Resultados
Buccellato et al., 2011	Modelo de EAE crônica remitente induzido por homogenato de medula espinal	Extratos ricos em THC (50 mg/kg), CBD (50 mg/kg) ou THC+CBD (25+25 mg/kg) (i.p.)	Redução de déficit neurológico pelo THC, e CBD apenas durante a fase de crise.
Kozela et al., 2011	Modelo de EAE induzido por MOG35-55	CBD 5 mg/kg (i.p.)	Redução de linfócitos T na medula espinal e na reatividade microglial.
Hilliard et al., 2012	Modelo de EAE crônica remitente induzido por homogenato de medula espinal	Extratos ricos em THC (5 mg/kg), CBD (5 mg/kg) ou THC+CBD (5+5 mg/kg) (i.p.)	A comparação entre o extrato contendo THC e CBD foi eficiente na inibição da espasticidade.
Mecha et al., 2013	Modelo viral de Theiler	CBD 5 mg/kg (i.p.)	Diminuição na infiltração de células imunes no cérebro, redução de reatividade microglial no cérebro e na medula espinal, melhora do déficit motor, e possível envolvimento de receptores de adenosina A2A.
Feliú et al., 2015	Modelo viral de Theiler	Extratos ricos em THC (5 mg/kg), CBD (5 mg/kg) ou THC+CBD (5+5 mg/kg) (i.p.)	Recuperação a morfologia da bainha de mielina, prevenção do dano axonal na medula espinal, diminuição de leucócitos infiltrados, diminuição de reatividade glial e de expressão de citocinas.
Moreno-Martet et al., 2015	Modelo de EAE induzido por MOG35-55	Extratos ricos em THC (10 mg/kg), CBD (10 mg/kg) ou THC+CBD (10+10 mg/kg) (i.p.)	A combinação THC e CBD e apenas THC foram mais eficazes em manter a redução dos scores clínicos ao longo do tempo, podendo ser mediado pelo receptor CB1
Rahimi et al., 2015	Modelo de EAE induzido por MOG35-55	CBD (5 mg/kg), PEA (5 mg/kg) ou CBD+PEA (5 mg/kg) (i.p.)	Melhora na progressão dos scores comportamentais, na desmielinização, infiltração de células imunes e reatividade microglial na medula espinal, diminuição de citocinas pró-inflamatórias.
Alberti et al., 2017	Modelo de EAE induzido por MOG35-55	Pré-tratamento de linfócitos obtidos dos animais EAE com β-cariofileno (1-100 µM), seguido de estimulação imunológica com MOG35-55; tratamento com β-cariofileno 25-50 mg/kg via oral	Inibição da resposta de linfócitos T e produção de citocinas pró-inflamatórias, melhora nos scores clínicos e peso, estresse inflamatório e desmielinização na medula espinal.
Elliott et al., 2018	Modelo de EAE induzido por MOG35-55	CBD 20 mg/kg (i.p.)	Indução de células supressoras de origem mieloide, inibição de proliferação de linfócitos T, diminuição de liberação de citocinas pró-inflamatórias, diminuição dos scores clínicos.
Zhou et al., 2019	Modelo de EAE induzido por MOG35-55	Extrato de CBD:THC (10:10 e 1:20) 215 mg/kg via oral	A combinação de THC e CBD foi eficaz na redução dos scores clínicos, redução de citocina pró-inflamatória e aumento de BDNF.

2.4. Doença de Parkinson

2.4.1. Modelos não-clínicos mais utilizados

Os modelos utilizados para a doença de Parkinson tentam mimetizar a característica principal desta patologia neurodegenerativa, que é a morte de neurônios dopaminérgicos e consequente perda do controle motor. Para isso, os principais modelos utilizados atualmente são os modelos de administração de neurotoxinas em animais (JACKSON-LEWIS; BLESA; PRZEDBORSKI, 2012). O modelo animal clássico de doença de Parkinson é a administração de 6-hidroxidopamina (6-OHDA), um composto com estrutura semelhante à dopamina, que precisa ser injetado diretamente na substância nigra (área afetada pela neurodegeneração na doença de Parkinson) ou no estriado, e quando é captada pelos neurônios dopaminérgicos, leva à morte dos mesmos, à perda de conexões e produção de lesões nessas regiões (UNGERSTEDT, 1968). Outra neurotoxina utilizada é a 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP), uma toxina que também é captada pelos neurônios dopaminérgicos e quando metabolizada pela célula, é capaz de afetar o metabolismo mitocondrial, levando ao desenvolvimento dos principais marcos da doença de Parkinson, como estresse oxidativo, distúrbios de metabolismo e processos inflamatórios, tornando-o o padrão ouro para as pesquisas utilizando modelo animal de doença de Parkinson (CHIUEH, et al., 1984).

Modelos utilizando pesticidas também são bastante usados em estudos da doença de Parkinson, uma vez que se especula que essa patologia possa se desenvolver pela exposição a essas toxinas. O paraquat, muito utilizado na agricultura como herbicida, age sobre o ciclo redox, gerando espécies reativas de oxigênio que levam ao dano celular por estresse oxidativo. Apesar de não ser um modelo tão específico, a administração desse composto auxilia no estudo da formação dos corpos de Lewy, agregados proteicos característicos da doença de Parkinson. A rotenona, também um pesticida e herbicida, tem capacidade de replicar quase todos os marcos da doença de Parkinson, como o estresse oxidativo, produção de agregados proteicos, inflamação e distúrbios comportamentais (BERRY; LA VECCHIA; NICOTERA, 2010; GREENAMYRE et al., 2010).

Existem também alguns modelos genéticos focando principalmente em mutações no gene de algumas proteínas cujas alterações são consideradas importantes para o desenvolvimento da doença de Parkinson em humanos, como PINK1/Parkina e α-sinucleína. Esses modelos são utilizados com bem menos frequência, devido ao custo de desenvolvimento (JACKSON-LEWIS; BLESA; PRZEDBORSKI, 2012). 

2.4.2. Estudos não-clínicos utilizando fitocanabinoides

Os efeitos neuroprotetores do Δ⁹-THC e CBD, bem como as possíveis vias de atuação dessas moléculas, têm sido bastante estudados em modelos in vitro de toxicidade relacionados à doença de Parkinson. Entretanto, para se obter resultados mais robustos envolvendo os efeitos sobre certas manifestações clínicas da doença, é necessário que estudos sejam feitos utilizando modelos animais para avaliação do sistema como um todo, e nesse sentido, os estudos envolvendo a doença de Parkinson e os fitocanabinoides ainda são bastante preliminares.  

O uso de fitocanabinoides tem apresentado resultados positivos em modelos da doença de Parkinson induzidos em roedores. Usando o modelo da 6-OHDA e tratamento consecutivo com CBD ou THC isolados na concentração de 3mg/kg via intraperitoneal, em ratos, Lastres-Becker e colaboradores observaram uma recuperação nos níveis de dopamina e DOPAC (um metabólito da dopamina), e na atividade da enzima TH, tanto na substância nigra quanto no estriado (LASTRES-BECKER et al., 2005). Dois anos mais tarde, utilizando o mesmo modelo de tratamento com CBD isolado, o grupo mostrou que os efeitos neuroprotetores só eram eficientes se o tratamento fosse iniciado concomitantemente à lesão. Ainda nesse trabalho foi visto que o CBD promoveu aumento da expressão do RNAm da enzima Cu,Zn – Superóxido Dismutase (SOD1) sugerindo que um possível mecanismo de atuação antioxidante deste composto (GARCÍA-ARENCIBIA et al., 2007).

Outros componentes da Cannabis, além do CBD e Δ⁹-THC, também já foram utilizados como estratégias terapêuticas em modelos experimentais da doença de Parkinson. O β-cariofileno, apresentou efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios, reduzindo a morte de neurônios dopaminérgicos tanto na substância nigra quanto no estriado, em modelo de doença de Parkinson induzido por rotenona (OJHA et al., 2016). Além disso, a Δ9-tetra-hidrocanabivarina (Δ⁹-THCV), um fitocanabinoide minoritário, também apresentou efeitos neuroprotetores em um modelo induzido por 6-OHDA (GARCÍA et al., 2011) (Figura 5; Tabela 4).

Artigo	Modelo	Composto utilizado	Resultados
Lastres-Becker et al., 2005	Indução por administração de 6-hidroxidopamina	CBD ou THC 3 mg/kg (i.p.)	Recuperação nos níveis de dopamina e metabólitos, aumento na atividade da enzima TH.
García-Arencibia et al., 2007	Indução por administração de 6-hidroxidopamina	CBD 3 mg/kg (i.p.)	O efeito do CBD só se mostrou eficiente se iniciado ao mesmo tempo que a lesão. Aumento da expressão de enzimas antioxidantes.
García et al., 2011	Indução por administração de 6-hidroxidopamina	Δ9-THCV (2 mg/kg) (i.p.)	Administração crônica atenuou a perda de neurônios dopaminérgicos, relacionado a+à capacidade antioxidante.
Ojha et al., 2016	Indução por administração de rotenona	β-cariofileno 50 mg/kg (i.p.)	Efeito antioxidante e anti-inflamatório, redução de morte de neurônios dopaminérgicos.

2.5. Doença de Alzheimer e demência

2.5.1. Modelos não-clínicos mais utilizados

A maioria dos modelos experimentais utilizados atualmente para estudo da doença de Alzheimer envolvem a geração de animais transgênicos. Esses animais são geneticamente desenvolvidos para superexpressar genes humanos associados ao surgimento da doença de Alzheimer, resultando na formação das placas amiloides, um dos marcos dessa patologia neurodegenerativa, e levando ao prejuízo cognitivo associado à memória (DRUMMOND; WISNIEWSKI, 2017).

Um dos primeiros modelos transgênicos de doença de Alzheimer desenvolvido foi o modelo de camundongos expressando o gene para APP (do inglês amyloid precursor protein), uma proteína que, quando clivada de forma incorreta, leva à geração das placas amiloides e mutação no gene FAD (Familial Alzheimer Disease), podendo também expressar os genes PSEN1 ou PSEN2, conhecidamente relacionado à expressão de proteínas envolvidas na formação das placas amiloides. Essas mutações basicamente levam a um modelo associado à doença de Alzheimer com formação de placas amiloides no córtex e no hipocampo, reatividade glial, e prejuízo sináptico e cognitivo. 

Baseando-se nesse modelo, foram desenvolvidos diversos tipos diferentes de mutações em APP e FAD, levando a maior ou menor desenvolvimento patológico e consequente piora na neuropatologia, podendo também ser relacionada com o desenvolvimento da doença de forma precoce ou tardia (TANZI et al., 1987; MUCKE et al., 2000; XU et al., 2015). Contudo, esse modelo não é tão bom em mimetizar a neurodegeneração em si e nem o surgimento de emaranhados neurofibrilares. Para isso, foram desenvolvidos modelos transgênicos de animais expressando a proteína tau humana (MAPT), importante para a produção desses emaranhados intracelulares de proteínas envolvidos na neurodegeneração, podendo ser expressões em concomitância com mutações em APP e/ou PSEN1 e PSEN2, promovendo a formação de placas e emaranhados neurofibrilares (BOLMONT et al., 2007; GRUENINGER et al., 2010; LEWIS et al., 2000). Alguns modelos utilizam também primatas não-humanos, que apresentam uma homologia muito maior com as características neuropatológicas da doença de Alzheimer, representando um modelo mais fisiológico da doença do que os roedores transgênicos (BRAIDY et al., 2015).

2.5.2. Estudos não-clínicos utilizando fitocanabinoides

Em relação à doença de Alzheimer, dados prévios utilizando drogas sintéticas moduladoras do sistema endocanabinoide, especialmente nos estudos não-clínicos, mostram que a ação sobre esse sistema tem potencial em promover melhorias em determinados aspectos fisiopatológicos da doença. Contudo, assim como a doença de Parkinson, ainda existem poucos estudos não-clínicos em animais utilizando fitocanabinoides. Em modelos animais de doença de Alzheimer, o papel anti-inflamatório dos fitocanabinoides já foi evidenciado. Ratos que receberam injeções de peptídeos Aβ (formadores das placas) diretamente no hipocampo, o tratamento por 15 dias com CBD 10 mg/kg levou à redução da neuroinflamação e aumento da neurogênese hipocampal.

Foi observado, no hipocampo desses animais, que a administração de Aβ levou ao aumento de marcadores de reatividade astrocitária e de neuroinflamação, os quais foram reduzidos pelo tratamento com CBD. Além disso, observou-se também uma proteção do CBD na redução do marcador de neurônios GABAérgicos (que são inibitórios) observado nos animais com doença de Alzheimer. Estes efeitos observados pelo CBD foram abolidos com a administração de GW9662, um bloqueador de PPARγ, envolvido em processos inflamatórios, sugerindo o envolvimento deste receptor nos benefícios observados com o tratamento do CBD (ESPOSITO et al., 2011). Adicionalmente, o mesmo grupo de pesquisadores também observou em hipocampo de camundongos injetados com Aβ, o efeito protetor do tratamento com CBD 2,5 mg/kg ou 10 mg/kg por 7 dias na redução de parâmetros inflamatórios (ESPOSITO et al., 2007). 

Estudos também tentaram avaliar o papel de sinergia do Δ⁹-THC e CBD em modelos animais de doença de Alzheimer. Aso e colaboradores avaliaram em camundongos APP/PS1 o papel neuroprotetor do tratamento com Δ⁹-THC e CBD de forma isolada ou em associação por cinco semanas, e observaram que os animais tratados tanto com os fitocanabinoides isolados quanto em associação apresentavam melhoras na memória e aprendizado. Contudo, apenas os animais que receberam Δ⁹-THC + CBD tiveram uma redução dos níveis de Aβ42 solúvel e reatividade glial no córtex cerebral (ASO et al., 2015). Em contrapartida, quando o mesmo grupo repetiu o desenho experimental em camundongos mais velhos, os resultados positivos foram perdidos, sugerindo que os mecanismos de ação mediados por esses fitocanabinoides podem ser mais eficazes em estágios iniciais da doença de Alzheimer (ASO; ANDRES-BENITO; FERRER, 2016) (Figura 6; Tabela 5).

Além disso, alguns estudos utilizando outros modelos de demência não originária do Alzheimer também têm mostrado resultados promissores quanto à melhora cognitiva promovida pelo uso de fitocanabinoides. Bilkei-Gorzo e colaboradores demonstraram que utilizando baixas concentrações de THC em animais envelhecidos, que apresentam um declínio cognitivo relacionado a idade, apresentaram uma melhora dependente do receptor CB1 tanto no aprendizado quanto na memória, podendo ser comparado à performance de animais jovens que não receberam THC. Além disso, foi observado um aumento na expressão de marcadores sinápticos e densidade de espinhas dendríticas no hipocampo, aumento na expressão de genes relacionados à fatores envolvidos com a melhora cognitiva, como a neurotrofina BDNF, e diminuição de genes relacionados à fatores envolvidos com morte celular, aumento na ativação de CREB, importante fator envolvido com a plasticidade sináptica e consolidação de memória e aprendizado (BILKEI-GORZO et al., 2017).

Esse trabalho é corroborado por Sarne e colaboradores em 2018, que utilizando também baixas doses de THC, observaram que animais mais velhos tiveram uma performance em relação à memória e aprendizado melhorados, podendo ser comparada com a de animais jovens que não receberam THC, e que duraram por no mínimo 7 semanas. Além disso, observou-se um aumento na expressão de SIRT1, uma enzima envolvida com plasticidade e neuroproteção, além de um aumento na densidade tecidual e volume de regiões como córtex pré-frontal e hipocampo desses animais (SARNE et al., 2018) (Tabela 5).

Artigo	Modelo	Composto utilizado	Resultados
Esposito et al., 2007	Administração de peptídeos Aβ (1-42) no hipocampo de camundongos	CBD 2,5 ou 10 mg/kg (i.p.)	Redução de parâmetros inflamatórios como reatividade glial, citocinas e enzimas pró-inflamatórias de forma dose-dependente.
Esposito et al., 2011	Administração de peptídeos Aβ (1-42) no hipocampo de ratos	CBD 10 mg/kg (i.p.)	Redução da neuroinflamação, de reatividade glial e aumento na neurogênese no hipocampo, proteção de neurônios inibitórios, e envolvimento de PPARγ.
Aso et al., 2015	Linhagem de camundongos APP/PS1	Extratos contendo THC (0,75 mg/kg), CBD (0,75 mg/kg) ou THC (0,75 mg/kg) + CBD (0,75 mg/kg)  (i.p.)	A combinação THC+CBD reduziu os níveis de Aβ42 e da reatividade glial no córtex cerebral.
Aso, Andres-Benito, Ferrer, 2016	Linhagem de camundongos APP/PS1	Extrato contendo THC (0,75 mg/kg) + CBD (0,75 mg/kg) (i.p.)	Não houve melhora nos parâmetros de reatividade glial e níveis de Aβ42, sugerindo que os efeitos dos fitocanabinoides dependem da progressão da doença.
Bilkei-Gorzo et al., 2017	Animais mais velhos (12 e 18 meses)	THC 3 mg/kg via minibomba osmótica	Melhora na performance cognitiva nos animais mais velhos, aumento em marcadores sinápticos, maior densidade de espinhas dendríticas no hipocampo, aumento na expressão de genes de proteínas e fatores relacionados com neuroproteção e diminuição da expressão de marcadores de morte celular.
Sarne et al., 2018	Animais mais velhos (24 meses)	THC 0,002 mg/kg (i.p.)	A dose muito baixa de THC foi capaz de aumentar SIRT1, promover aumento de volume e densidade de tecidos cerebrais e melhorar parâmetros cognitivos.

2.6. Dor Crônica

2.6. Modelos não-clínicos mais utilizados

O conceito de dor crônica é bastante extenso, uma vez que o processo de dor pode ocorrer em qualquer região do organismo, além da possibilidade de ser consequência de uma patologia pré-estabelecida. Assim, diversos modelos animais de dor crônica foram desenvolvidos de forma a abranger a variedade de patologias associadas, comorbidades e características de cada processo. A maioria dos estudos é feita principalmente com roedores, e tem como foco a modulação dos processos de transmissão dos impulsos dolorosos pela medula espinal, local chave para o desenvolvimento desses processos aberrantes (BURMA et al., 2016). 

O modelo animal mais comum de desenvolvimento de dor neuropática periférica é a indução de injúria do nervo, por ligação, compressão ou transecção, podendo ser realizada nos nervos isquiático, infraorbital ou trigêmeo, mimetizando a dor neuropática causada após trauma (WALL et al., 1979; BENNETT; XIE, 1988; SELTZER et al., 1990). Modelos de dor central são mais difíceis de serem desenvolvidos e acabam sendo restritos a lesões na medula espinal. Outros tipos de modelos não-clínicos de dor neuropática envolvem indução química ou metabólica associada à administração de quimioterápicos ou antirretrovirais e diabetes e esclerose múltipla. Estes modelos podem ser utilizados para estudar dor associada a patologias (WANG; WANG, 2003; AUTHIER et al., 2009).

A dor crônica pode se desenvolver também por inflamações crônicas; assim, modelos envolvendo administração de compostos químicos irritantes têm sido utilizados para mimetizar esse tipo de condição, como por exemplo, formalina e adjuvante de Freund, podendo se estender dependendo do tempo de estudo (STEIN et al., 1988; ZHANG; REN, 2011). Existem também modelos específicos para certas doenças como artrite por exemplo, artrite induzida por colágeno (MYERS et al., 1997), e modelos cirúrgicos envolvendo transecção de ligamentos ou injeção intra-articular de toxinas, como no caso de modelos para osteoartrite (GUZMAN et al., 2003; FANG; BEIER, 2014).

Modelos para dor crônica como enxaquecas, dores musculares e viscerais ainda são de certa forma, bastante restritos, uma vez que a origem da dor nessas regiões pode variar em suas causas. Os modelos ainda são pouco abrangentes, podendo-se empregar, por exemplo, indução de vasodilatação e estimulação nervosa direta, no caso dos modelos para enxaqueca, indução química por agentes irritantes no caso de dores de origem musculoesquelética e modelos de distensão visceral no trato digestório e trato urinário, por exemplo, para síndromes de dor visceral (BURMA et al., 2016).

2.6.2. Estudos não-clínicos utilizando fitocanabinoides

Em relação à pesquisa não-clínica envolvendo fitocanabinoides e modelos de dor crônica, ainda existem poucos trabalhos capazes de fornecer uma robustez de resultados acerca dos mecanismos de ação desses compostos nessa patologia. Destaca-se a atuação das moléculas como terpenos e flavonoides, que atuam em sinergia com os fitocanabinoides. Já foi descrito que a administração apenas do β-cariofileno é capaz de reverter a alodinia mecânica e diminuir a resposta inflamatória na medula espinal em modelo animal de dor crônica causada pelo uso de quimioterápicos (SEGAT et al., 2017; MAAYAH et al., 2020). Outros terpenos como β-mirceno e α-pineno já foram descritos por atuarem sobre receptores adrenérgicos e enzima ciclooxigenase 2 (COX2), e levar ao efeito analgésico e anti-inflamatório (MAAYAH et al., 2020). O tratamento com diferentes flavonoides em diversos modelos animais de dor crônica (pelo uso de quimioterápicos ou lesão no sistema nervoso periférico) teve efeito positivo na reversão da alodinia mecânica e hiperalgesia térmica, em especial pela ação anti-inflamatória desses compostos (SIDDIQUI et al., 2021).

Um trabalho publicado em 2020 (BRITCH et al., 2020) investigou os efeitos de doses únicas ou repetitivas de Δ⁹-THC e CBD em ratos adultos machos e fêmeas submetidos a modelo de dor inflamatória crônica por injeção de adjuvante de Freund. Os autores descreveram que tanto em fêmeas quanto em machos, o Δ⁹-THC teve efeito de reverter alodinia e hiperalgesia; porém, somente nas fêmeas a administração desse fitocanabinoide foi capaz de levar ao aumento significativo do peso suportado na pata inflamada. Já com a administração de CBD, em ambos os sexos se observou diminuição expressiva de IFN-δ na pata inflamada; contudo, somente em machos houve a diminuição significativa de TNF-α e somente em fêmeas houve o aumento de IL-6.

Rouhollahi e colaboradores (2020) compararam o efeito de dois extratos com concentrações distintas de fitocanabinoides: um mais rico em CBD (CT-921) e outro mais rico em Δ⁹-THC (CT-928) em modelo de dor crônica por lesão no sistema nervoso periférico. Apesar da dose necessária de extrato para uma melhora na alodinia de 50% dos animais seja menor do extrato CT-928 do que o CT-921, o extrato rico em CBD apresentou uma relação eficácia/efeito adverso melhor que o extrato rico em Δ⁹-THC. Animais que fizeram uso do extrato CT-928 tiveram diminuição da frequência respiratória, sinais de hiperatividade e alguns, morte (Aviram e Samuelly-Leichtag, 2017) (Figura 7; Tabela 6).

Artigo	Modelo	Composto utilizado	Resultados
Segat et al., 2017	Dor causada por administração de quimioterápicos	β-cariofileno 25 mg/kg via oral	Reversão da alodinia mecânica, diminuição da resposta inflamatória na medula espinal.
Britch et al., 2020	Dor causada por adjuvante de Freund	THC (2 mg/kg) ou CBD (10 mg/kg) (i.p.)	THC reverteu a alodinia e hiperalgesia em machos e fêmeas, mas em fêmeas também foi capaz de aumentar a capacidade de suportar o peso no membro inflamado. CBD foi capaz de diminuir citocinas pró-inflamatórias.
Rouhollahi et al., 2020	Dor causada por lesão no nervo ciático	Extrato rico em CBD (5-45 mg/kg) ou THC (1-10 mg/kg) (i.p.)	O extrato rico em THC teve mais eficácia em menores doses do que o CBD em promover efeito antinociceptivo, porém o CBD apresentou um perfil efetividade/efeito adverso melhor.

3. Considerações finais

A pesquisa não-clínica é de imensa importância dentro da farmacologia para a descoberta de novos fármacos que possam mitigar ou pelo menos amenizar os sintomas de diversas doenças existentes. Esses estudos permitem uma observação em “lente de aumento” para os mecanismos celulares e moleculares que ocorrem em patologias, que não podem ser observadas utilizando pacientes humanos, e assim permitem que, ao detectar um possível alvo farmacológico, se saiba como desenvolver uma nova ferramenta terapêutica. Dentro do estudo com fitocanabinoides, a etapa da pesquisa não-clínica, que canonicamente deve ser a primeira antes do uso em humanos, foi praticamente negligenciada por uma questão de emergência, uma vez que os extratos de Cannabis foram introduzidos na clínica de modo informal e de certa forma, empírico. Hoje, diversos grupos têm tentado elucidar os mecanismos de ação desses fitocanabinoides de forma a corroborar cientificamente o uso desses compostos em patologias, principalmente de origem neurológica ou neuropsiquiátrica, e poder até mesmo avaliar o emprego em outras doenças fora do sistema nervoso central, determinando parâmetros como dosagens, toxicidade, farmacocinética, efeitos adversos, de forma a empregá-las de forma segura e eficaz em humanos.

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Este texto é uma contribuição de conteúdo para melhor direcionamento dos interessados no tema. Não foi exigido metodologia ABNT, podendo ou não ser adotado pelos autores. Foi orientado um texto que possa guiar, nortear o leitor para se desenvolver e dar sequência no assunto. Podendo haver contato com os autores para parcerias, sugestões. A ABICANN se coloca como uma facilitadora para o desensenvolmento técnico científico sobre cannabis e canabinoides pois temos a missão de auxiliar o setor.

AUTORAS:

Yolanda Paes Colli, M.Sc., Farmacêutica

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Isabela Favorito Santos, M.Sc., Biotecnologista

contatotimecannabis@gmail.com 

Raquel Maria Pereira Campos, PhD, Biomédica

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REVISOR:

Francisney Nascimento, PhD, UNILA

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Caroline Rodrigues, PhD, UEG

rodrigues.caroline.r@gmail.com

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